图8。CD13的产生⁺和CD15⁺StemSpan™SFEM II中含有髓细胞扩增剂的人脑源性细胞的扩增和谱系特异性分化

人脑源性CD34培养14天的流式细胞术点图⁺在StemSpan™SFEM II中含有髓细胞扩增补充剂的细胞在培养前和培养后14天(B)分别表达HSPC标记CD34和泛造血标记CD45 (A)，培养后14天表达髓细胞标记CD13和CD15 (C)。CD34的频率⁺细胞从培养前的83%下降到培养14天后的~1%。同时，髓细胞CD13⁺CD15⁺细胞从第0天的<10%逐渐积累到第14天的46%。CD14的频率⁺培养后细胞数量低（通常<10%）。

图9。CD14的产生⁺人cbcd34扩增和谱系特异性分化的单核细胞⁺StemSpan™SFEM II中含有髓系扩增物的细胞培养

人CD34细胞培养14天的流式细胞术点图⁺StemSpan™SFEM II中含有髓系扩增补充物II的细胞。图中显示了CD34和CD45在培养前(A)和培养后(B)的表达情况，以及CD13和CD14在扩增细胞上的表达情况。CD34的频率⁺细胞从培养前的87%下降到培养14天后的1%以下。CD14⁺单核细胞从第0天的< 5%增加到第14天的90%。

图10。CD4 ISP和CD4的频率和产率⁺CD8⁺培养42天后的DP细胞

CB-derived CD34⁺细胞（新鲜分离或冷冻）用StemSpan™T细胞生成试剂盒（目录#09940）培养42天，(A)通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD3和TCRαβ的表达。(B) CD4 ISP的频率和(C)产率，双阳性(CD4⁺CD8⁺)和CD3⁺细胞受体αβ⁺-表达双阳性细胞(CD4⁺CD8⁺CD3⁺细胞受体αβ⁺)所示。DP （CD4）细胞平均占总活菌群的38%⁺⁺)，其中35%共表达CD3和TCRαβ。总DP细胞和CD3的产率⁺细胞受体αβ⁺DP细胞每输入CD34⁺细胞数分别为~23,000和~9,000。所示为95%置信区间的平均值（n = 31）。

图11。培养49天后CD8 SP T细胞的频率和产量

通过在StemSpan™SFEM II中添加T细胞祖细胞成熟补充剂（目录#09930）、IL-15（目录#78031）和ImmunoCult™CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂（目录#10970），在涂膜板上再培养7天，DP细胞进一步成熟为CD8 SP T细胞。第49天，流式细胞术(A)检测细胞CD3、TCRαβ、CD4和CD8的表达。CD3的(B)频率和产率⁺细胞受体αβ⁺-表达细胞及其子集。平均有54%的CD3⁺细胞受体αβ⁺细胞DP （CD4）⁺CD8⁺CD8 SP （CD4）占38%^-CD8⁺）. 每个输入CD34的CD8 SP T细胞的平均产量⁺细胞为~ 6000。CD3⁺细胞受体αβ⁺Cd4 sp (Cd4⁺CD8^-) T细胞的检测频率非常低（数据未显示）。所示为95%置信区间的平均值（n = 12）。

图12。CD56的频率和产率⁺培养28天后的NK细胞

CB-derived CD34⁺细胞（新鲜分离或冷冻）用StemSpan™T细胞生成试剂盒（目录#09940）培养42天，(A)通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD3和TCRαβ的表达。(B) CD4 ISP的频率和(C)产率，双阳性(CD4⁺CD8⁺)和CD3⁺细胞受体αβ⁺-表达双阳性细胞(CD4⁺CD8⁺CD3⁺细胞受体αβ⁺)所示。DP （CD4）细胞平均占总活菌群的38%⁺⁺)，其中35%共表达CD3和TCRαβ。总DP细胞和CD3的产率⁺细胞受体αβ⁺DP细胞每输入CD34⁺细胞数分别为~23,000和~9,000。所示为95%置信区间的平均值（n = 31）。

图13。StemSpan™媒体支持原始人类CD34同等或更高的扩增^明亮的CD90⁺CD45RA^-细胞比其他商业媒体

纯化的cb衍生CD34⁺细胞在StemSpan™培养基（SFEM、SFEM II、AOF和XF，橙色条）和其他供应商的五种培养基（Commercial Alternative，灰色条）中培养7天。所有培养基补充StemSpan™CD34⁺扩展补充和UM171*。(A)活细胞CD34的频率和(B)细胞扩增⁺CD90⁺CD45RA^-（固体）和CD34^明亮的CD90⁺CD45RA^-（虚线覆盖）用流式细胞术分析培养细胞，如图1所示。与竞争对手的培养基相比，StemSpan™培养基显示出相似或显著更高的CD34扩增^明亮的CD90⁺CD45RA^-将StemSpan™SFEM II和XF与其他供应商的五种培养基进行比较时，P < 0.05，使用单向方差分析和Dunnett事后检验计算)。CD34的^明亮的CD90⁺CD45RA^-功能干细胞/祖细胞的细胞群高度富集。所示数据为平均值±SEM （n = 8）。

*当使用最终浓度为1μM的UM729（目录#72332）时，预计会出现类似的结果。欲了解更多信息，包括UM171和UM729的比较数据，请参见Fares et al. 2014。

注：显示的StemSpan™-AOF数据是用原始含酚红版本（目录#09855）生成的。然而，内部测试表明，新的无酚红，cgmp制造版本的StemSpan™-AOF（目录#100-0130）的性能是可比的。

图14。StemSpan™媒体支持更好的CD34⁺和原始CD34⁺CD90⁺CD45RA^-HSPC在基因组编辑应用中的扩展与替代商业媒体的比较

纯化的cb衍生CD34⁺细胞在选定的StemSpan™培养基（StemSpan™SFEM II或StemSpan™-AOF，橙色条）或其他供应商提供的五种无xeno培养基配方（灰色条）中培养2天。所有培养基补充StemSpan™CD34⁺扩展补充和UM171*。然后使用含有crRNA：靶向β -2微球蛋白（B2M）的tracrRNA的architect™CRISPR-Cas9 RNP复合物电穿孔细胞，并在相同条件下再培养4天。通过MHC-I染色和流式细胞术分析，敲除效率在所有培养基中都是相似的，约为70-80%。(A) CD34的百分比⁺(B) CD34⁺CD90⁺CD45RA^-电穿孔后4 d流式细胞术定量细胞。所示数据为平均值+标准差(n = 4个供体；** p < 0.01)。

*当使用最终浓度为1 μM的UM729（目录#72332）时，预计会出现类似的结果。欲了解更多信息，包括UM171和UM729的比较数据，请参见Fares et al., 2014。

注：显示的StemSpan™-AOF数据是用原始含酚红版本（目录#09855）生成的。然而，内部测试表明，新的无酚红，cgmp制造版本的StemSpan™-AOF（目录#100-0130）的性能是可比的。

图15。CD34的集落形成潜能⁺CML细胞在培养过程中得到维持

CD34后直接使用MethoCult™H4435富集培养基进行CML细胞集落检测⁺细胞分离（第0天）或在没有或有UM171的情况下扩增7天或14天后（如图2所示）。在StemSpan™SFEM II中加入CD34培养14天后⁺扩增补充物（Exp）含或不含UM171，菌落(A)用STEMvision™成像，并从数字图像中手动计数。(B) CFU输出以每个原始输入CD34的菌落总数表示⁺细胞。每个单独条形图上方的数字表示BCR-ABL阳性菌落的比例，通过qRT-PCR对6个不同样品的单个采摘菌落进行测量（每种条件下每个样品采摘8-12个菌落）。SFEM II补充CD34⁺扩展补充剂（Exp）支持培养中集落形成祖细胞的扩展。UM171进一步促进集落形成的祖细胞输出（在第7天和第14天扩增~3.5倍）。单菌落qRT-PCR分析显示，从第0天的样品中产生的菌落，以及从扩增7天和14天的细胞中产生的菌落，主要是BCR-ABL⁺还有正常的BCR-ABL^-祖细胞以低频率存在。所示数据为平均值±SEM （n = 6）。P值采用双尾配对Student’s t检验计算（*P < 0.05）。

图16。CD34的集落形成潜能⁺AML细胞在培养过程中得以维持

AML细胞，CD34后⁺细胞分离（第0天）或在无UM171或有UM171的情况下扩增7天或14天后（如图3所示），用MethoCult™H4435富集培养基进行菌落测定。孵育14天后，用STEMvision™对菌落进行(A)成像，并从数字图像中手动计数。(B) CFU输出以每个原始输入CD34的菌落总数表示⁺细胞。SFEM II补充CD34⁺扩展补充剂（Exp）支持培养中集落形成祖细胞的扩展。添加UM171进一步促进了集落形成祖细胞的输出（第7天和第14天分别增加了3倍和4倍）。所示数据为平均值±SEM （n = 6）。P值采用双尾配对Student’s t检验计算（*P < 0.05）。