CRISPR指南设计工具和算法

CRISPR指南设计工具使用最佳实践和最新的计算工具，为人类和小鼠基因组中的每个基因提供最佳的CRISPR RNA （crRNA）或单指南RNA （sgRNA）序列。

目标排名

从目标基因组中提取所有具有敲除基因能力的候选靶标，即靶标的切割位点与特定基因的编码区域重叠。例如，我们确定了9,967,686个针对人类基因组编码区（GRCh38）的引导序列。

每个基因的目标首先根据通过特定阈值的特定参数进行排序，通过的参数被赋予最高优先级。参数包括瞄准和脱靶分数，基因内的相对位置，单核苷酸多态性（SNP）概率，以及覆盖的同型异构体的分数（每个参数的描述和评分方法在下一节：参数评分中给出）通过某些阈值，通过的将被赋予最高优先级。各参数的阈值为：

1. 靶子得分≥0.4
2. 靶子得分≥0.4
3. 脱靶评分≥0.67
4. 相对目标位置≤0.5
5. SNP概率≤0.05
6. 覆盖分数> 0.5

注：在某些情况下，没有特定基因的指南满足所有阈值。在这些情况下，通过阈值的重要性排序如下：

SNP概率>分数覆盖>相对目标位置>脱靶得分>目标得分

还生成了特定同种异构体的顶级目标。它们使用上述所有标准，除了覆盖的部分，因为它不再相关。为了获得特定同种异构体的最佳目标，客户应该输入RefSeq同种异构体名称，而不是基因名称。注：仅包含已验证的mRNA和ncRNA （MN和NR）转录本。预测的mRNA和ncRNA （XM和XR）不计算在特定指南将靶向的同种异构体的比例中。

加权平均总体目标分数（范围0 - 1）是根据靶上强度、靶外能力、基因内的相对位置和转录本覆盖的分数来计算的。各参数的权重为：

1. 相对目标位置：0.4
2. 覆盖分数：0.4
3. 命中率：0.1
4. 脱靶得分：0.1

参数得分

目标的力量

grna的靶向特异性是由引导序列与相应基因组DNA序列的互补性决定的。为了使双链断裂（DSB）发生在导链指定的位置，导链序列和互补DNA序列之间必须发生强相互作用。根据强度的不同，DSB地层成功形成的概率也不同。

对每个目标生成一个非目标得分（得分在0 - 1之间），得分越高表示非目标强度越强。Doench等人(1)给出了确定目标得分的算法。

非目标能力

理想情况下，一个特定的指南将与目标序列具有100%的同源性，并且在基因组的其他地方没有同源性。然而，由于靶序列结合可以容忍多种错配，因此通常存在许多潜在的脱靶位点，其中包含一种或多种错配。

生成脱靶分数（0 - 1），表示脱靶切割的逆概率，分数越高表示脱靶潜力越低。

基因内的相对靶位

切割位点靠近基因n端的靶标更有可能导致功能性基因敲除。这是因为基因开头的移码会比末端的移码破坏更大比例的蛋白质。

相对目标位置是相对于蛋白质编码转录物编码区域的开始（范围0 - 1）进行评分的，其中较低的分数表明向导更靠近基因的n端。

SNP概率

目标与波导的不匹配会显著影响相互作用的强度；即使只有一个错配，也会显著降低引导序列和互补基因组序列之间的相互作用强度，导致切割/编辑效率降低。

SNP概率（范围0 - 1）表示目标序列中至少有一个碱基变异的可能性。目标携带SNP的概率是基于在目标序列中发现的SNP的数量，以及该SNP在人群中的等位基因频率。

注：SNP概率不包括小鼠指南，因为小鼠通常是近亲繁殖的。

覆盖转录本的比例

许多基因编码多种同种异构体。除非在设计工具中指定一个特定的同种异构体作为基因靶标，否则优先选择针对所有或大多数同种异构体的指南。仅包括已验证的mRNA和ncRNA （MN和NR）转录本。预测的mRNA和ncRNA （XM和XR）不计算在特定指南将靶向的同种异构体的比例中。