使用STEMdiff™培养基从人多能干细胞生成单核细胞

背景介绍

单核细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，由于其具有分化为巨噬细胞和树突状细胞的能力，可对病原体或肿瘤进行防御。 虽然单核细胞可以从外周血中分离出来，但人多能干细胞(hPSCs)提供了另一种潜在的、无限的单核细胞来源。 这些hPSC衍生的单核细胞可用于疾病建模、细胞治疗应用的开发和基础生物学研究。

STEMdiff™单核细胞试剂盒用于将hPSCs在无饲养层和无血清的培养条件下分化为单核细胞。

将hPSCs分化为单核细胞

STEMdiff™单核细胞试剂盒用于将hPSCs分化为单核细胞的三个胚层，如图1所示。 在第1阶段，培养3天后，使用培养基A将hPSCs分化为中胚层。 第2阶段，将细胞在培养基B中培养4天，促进其定向分化为造血祖细胞。 在第3阶段，使用单核细胞分化培养基促进祖细胞向单核细胞分化。 这些可以通过CD14的表达来识别，如图2所示。 STEMdiff™单核细胞试剂盒经过优化，可用于在TeSR™培养基中维持培养的多种胚胎干（ES）和诱导多能干（iPS）细胞系的分化。 分化后，hPSC衍生的单核细胞可用于其他下游检测。

生成巨核细胞实验方案

建议使用以下方案对 mTeSR™1、mTeSR™ Plus 或 TeSR™-AOF™ 中保存的 hPSC 进行扩增和巨核细胞分化。

使用此方案，每接种一个 hPSC 的细胞可获得 223 - 425 个 CD41a⁺ CD42b⁺ 巨核细胞，纯度范围为 56 - 77%。实验之间的细胞得率和比例可能会有所不同，具体取决于细胞系和分化培养开始时细胞的状况。 根据您的具体目标，可能需要进一步优化方案（例如测试不同的铺板密度、培养周期、以及补充培养基和重铺板频率）。

该程序已针对人 ES 和 iPS 细胞的使用进行了优化； 请参阅产品说明书（PIS；文档号 10000013343）了解完整说明。

1. 根据 PIS 中的方案，对 hPSC 传代进行聚合和分化设置。

注意：有关维持高质量人 ES 和 iPS 细胞以及用 Corning® Matrigel® 包板的完整说明，请参阅 mTeSR™1、mTeSR™ Plus 或 TeSR™ E8™ 技术手册，可在 www.stemcell 上获取 .com, 或联系我们索取电子版本。

造血分化实验方案

注意：在整个实验过程中，使用前将所有培养基预热至室温 (15 - 25°C)。 请勿将培养基长时间置于室温下。

1. 在第 0 天，确认 16 - 40 个克隆/孔粘附在培养皿上（4 - 10 个克隆/cm²；该方案基于 12 孔板，但可以适应其他培养皿尺寸）。 从孔中吸出培养基。
2. 每孔添加 1 mL 培养基 A（STEMdiff™ 造血基础培养基 + STEMdiff™ 造血添加物 A）。 将剩余的培养基 A 储存在 2 - 8°C 下直至下次使用。
3. 在 37°C 和 5% CO₂ 下孵育 2 天。
4. 第 2 天，从每个孔中轻轻取出 0.5 mL 培养基并丢弃。 每孔轻轻添加 0.5 mL 培养基 A。
5. 37°C 孵育 24 小时。
6. 第 3 天，从孔中吸出培养基。 每孔轻轻添加 1 mL 培养基 MK1（STEMdiff™ 造血基础培养基 + STEMdiff™ 巨核细胞添加物 MK1）。 将剩余的培养基 MK1 储存在 2 - 8°C 直至下次使用。
7. 37°C 孵育 2 天。
8. 根据 PIS，在第 5、7 和 10 天用培养基 MK1 进行全培养基更换，注意不要干扰悬浮的细胞群。
9. 每次更换培养基后，在 37°C 下孵育 2 天。
10. 第 12 天，按如下方式收获造血细胞：
    
    
    1. 上下吹打细胞以清洗孔并从贴壁细胞层中除去悬浮细胞。
    2. 将 1 mL StemSpan™ SFEM II 添加到孔中。 在孔中剧烈吹打并添加到收集管中。
    3. 对每个孔重复步骤 10a 和 10b。
    4. 在室温 (15 - 25°C) 下以 300 x g 离心收集管 5 分钟。
    5. 取出并丢弃上清液。
    6. 将细胞沉淀重悬于 StemSpan™ SFEM II 中，并使用台盼蓝和血细胞计数器进行活细胞计数。

巨核细胞分化实验方案

1. 第 12 天，向组织培养处理的 12 孔板的每个孔中添加 1 mL 培养基 MK2（StemSpan™ SFEM II + STEMdiff™ 巨核细胞添加物 MK2）。
2. 将收获的细胞（来自造血分化方案第 10 步）以 100,000 - 350,000 个细胞/mL 添加到每个孔中。
3. 37°C 孵育 5 天。
4. 第 17 天，按如下方式收获巨核细胞：
   
   
   1. 上下吹打细胞以清洗孔。
   2. 将细胞悬液转移至收集管中。
   3. 在室温 (15 - 25°C) 下以 300 x g 离心收集管 5 分钟。
   4. 取出并丢弃上清液。
   5. 将细胞沉淀重悬于所需培养基中，并进行活细胞计数以进行分析或下游测定。 CD41a+CD42b+巨核细胞群的纯度可以通过流式细胞术测定。

结果

图 2. 巨核细胞分化方案

按照图 1 中描述的方案，诱导 hES 和 hiPS 细胞分化为偏向巨核细胞-红细胞的 HPC。第 12 天，从上清液中收获细胞并分析 CD41a 的表达，通过流式细胞术检测 CD42b、CD34 和 GlyA。 通过光散射谱和碘化丙啶 (PI) 染色排除死细胞。 (A) 第 12 天 hES 衍生 (H9) 细胞的代表性流式细胞术图。显示高水平的 CD41a 和 CD42b 以及 CD34 和 GlyA 表达，表明该方案支持 hPSC 在第 12 天分化为巨核细胞-红系祖细胞。(B) 对于两个 hES 细胞系（H1 和 H9）和两个 hiPS 细胞系（WLS-1C 和 STiPS-R038），每个接种细胞分化的 CD41a⁺CD42b⁺ 细胞比例和得率。 第 12 天，活的 CD41a⁺ CD42b⁺ 细胞的平均比例在 33% 到 62% 之间。 平均每个接种细胞产生的 CD41a⁺CD42b⁺ 细胞的得率范围在 72 到 174 之间。数据显示为平均值 ± SEM（H1 为 n = 7，H9 为 n = 20，WLS-1C 为 n = 19，STiPS 为 n = 7 -R038）。

产品信息

需要但不包括的材料

推荐用于分析的抗体