如何冷冻保存外周血单核细胞（PBMCs）

材料

• 低温贮藏的媒介。选项包括:
  • CryoStor®CS10 (目录# 07930),或
  • 二甲基亚砜（DMSO）和胎牛血清（FBS）
• 低温小瓶(如：目录# 38053)
• 异丙醇冷冻容器(如康宁®CoolCell®(目录# 200 - 0642), Mr. Frosty™或控制速率的冰箱)
• 移液器(例如康宁®Lambda™Plus移液器，目录# 38060)
• 移液头(如康宁®过滤移液头，目录# 38034)

协议

选择1：使用CryoStor®CS10进行冷冻保存

1. 打开之前，用70%乙醇或异丙醇擦拭CryoStor®CS10容器的外部。
2. 标记低温小瓶。
3. 确保pbmc处于单细胞悬浮液中。300倍离心细胞g等待10分钟以获得细胞颗粒。
4. 用移液管小心地除去上清，留下少量培养基，以确保细胞颗粒不受干扰。
5. 轻轻拨动试管，使细胞颗粒重新悬浮。
6. 加入冷（2 - 8°C） CryoStor®CS10，充分混合，并将悬浮液转移到冷冻瓶中。
   
   
   请注意建议将分离的PBMCs以0.5 - 10 × 10的浓度冷冻⁶细胞/毫升。但是，您应该尝试以多种浓度冷冻细胞，以确定哪种浓度在解冻后能提供所需的活力、恢复和功能。较高的冷冻细胞浓度需要针对特定应用进行验证和优化，因为主要风险是活细胞的损失。
7. 细胞在2 - 8°C下孵育10分钟。
8. 冷冻保存细胞使用标准的慢速控制冷却方案（约-1°C/分钟）在控制速率的冷冻机上，或异丙醇冷冻容器（例如康宁®CoolCell®，Mr. Frosty™等）。如果使用异丙醇冷冻容器，将低温小瓶放入容器中，并将其放置在-80°C的冰箱中过夜。
9. 为了长期储存，将小瓶冷冻的pbmc从冷冻室或冷冻容器中转移到气相液氮中（低于- 135℃）。在转移到液氮的过程中，将小瓶放在干冰上，尽量减少暴露在室温下。
   
   
   请注意：不建议在-80℃下长期保存。

选择2:10% DMSO和90%胎牛血清冷冻保存

开始之前:

• 在启动本协议之前，确保所有介质都是冷的。
• 如果存在与使用FBS相关的安全问题，则应使用不含血清和动物成分的冷冻保存培养基，如CryoStor®CS10。

1. 在FBS中制备20% DMSO。保持冷静。
   
   
   请注意不要把100%二甲基亚砜放在冰上，否则会结晶体。用玻璃移液管吸DMSO。
2. 标记低温小瓶。
3. 确保pbmc处于单细胞悬浮液中。300倍离心细胞g等待10分钟以获得细胞颗粒。
4. 用移液管小心地除去上清，留下少量培养基，以确保细胞颗粒不受干扰。
5. 将pbmc在冷FBS中重悬至1 - 20 × 10的浓度⁶细胞/毫升。保持冷静。
6. 将细胞与20% DMSO以1:1的比例在FBS中轻轻混合。最后的细胞悬浮液为10% DMSO和90%胎牛血清。最终的细胞浓度将在0.5 - 10 × 10之间⁶细胞/毫升。快速将1毫升细胞悬液转移到每个冷冻瓶中。
   
   
   请注意你应该尝试以多种浓度冷冻细胞，以确定哪种浓度在解冻后能提供所需的活力、恢复和功能。
7. 将低温小瓶立即放入异丙醇冷冻容器（例如康宁®CoolCell®，Mr. Frosty™等）。将容器放入-80°C的冰箱中过夜。
   
   
   请注意不要将细胞置于室温下的低温保存介质中。保持在冰上并迅速转移。
8. 为了长期保存，将冷冻的小瓶pbmc转移到气相液氮中（低于-135℃）。在从-80°C冷冻库转移到液氮的过程中，将小瓶放在干冰上，尽量减少暴露在室温下。
   
   
   请注意：不建议在-80℃下长期保存。