如何解冻冷冻原代细胞
人原代细胞是直接从组织中分离出来的细胞，包括外周血、脐带血和骨髓。这些细胞在生物过程、疾病进展和药物开发研究中的重要性，以及在体外细胞检测或异种移植或人源化小鼠模型中的应用，日益得到认可。
新鲜原代细胞通常冷冻保存（即冷冻）长期储存在液氮中，如果他们不是立即需要。处理新鲜样品的资源有限的研究人员也可能购买冷冻的，随时可用的原代细胞包括单核细胞（MNCs）、纯化免疫细胞或造血干细胞。解冻冷冻细胞时，适当的技术和处理可确保下游应用的细胞的最佳活力，恢复和功能。
本方案描述了如何解冻冷冻原代细胞。由于特定细胞类型的解冻方案可能有所不同，请始终参考您的细胞收到的推荐方案。
新鲜原代细胞通常冷冻保存（即冷冻）长期储存在液氮中，如果他们不是立即需要。处理新鲜样品的资源有限的研究人员也可能购买冷冻的，随时可用的原代细胞包括单核细胞（MNCs）、纯化免疫细胞或造血干细胞。解冻冷冻细胞时，适当的技术和处理可确保下游应用的细胞的最佳活力，恢复和功能。
本方案描述了如何解冻冷冻原代细胞。由于特定细胞类型的解冻方案可能有所不同，请始终参考您的细胞收到的推荐方案。
材料
- 人原代细胞(冻结)
- ThawSTAR®CFT2自动解冻系统(目录# 100 - 0650)
- 推荐的媒介。选项包括:
- Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM）目录# 3615010%胎牛血清（FBS）；目录# 100 - 0179)添加
- DMEM含4500 mg/L d -葡萄糖(目录# 3625010%胎牛血清（FBS）；目录# 100 - 0179，只适用于指定地区)
- RPMI 1640中(目录# 36750)，添加10%的FBS
- 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(例如：Dulbecco's含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水；目录# 07905)
- 2 mL血清学移液器(如Falcon®血清学移液器，2 mL；目录# 38002)
- 25ml血清学移液器(如Falcon®血清学移液器，25ml；目录# 38005)
- 50 mL锥形管(例如Falcon®锥形管，50 mL；目录# 38010)
协议
第一部分：设置
- 37°C水浴加热培养基。推荐介质列表见资料。如果为下游解冻细胞细胞分离， PBS加2% FBS即可。
- 当从储存中取出冷冻细胞时，重要的是尽量减少暴露在室温下（15 - 25°C）。如果不直接解冻，将细胞放在干冰或液氮容器中。
- 用70%乙醇或异丙醇擦拭细胞瓶的外部。
- 在生物安全柜中，将瓶盖旋转四分之一圈以释放内部压力，然后重新拧紧。
- 在37°C的水浴中快速解冻细胞，轻轻旋转小瓶。当有少量冰残留时，取出小瓶。这大约需要1 - 2分钟。不要使细胞旋转。或者，使用ThawSTAR®CFT2自动解冻系统确保样品无菌和一致的解冻性能。有关更多资料，请参阅以下影片：如何使用ThawSTAR®CFT2自动解冻系统快速解冻冷冻细胞.
- 用70%乙醇或异丙醇再次擦拭瓶外。
- 在生物安全柜中，用2ml血清学移液管测量细胞悬液的总体积。该值在步骤13中用于计算提供的单元格总数。将细胞放回小瓶中混合悬浮液。
- 取20µL细胞进行计数。如果使用台盼蓝评估生存能力，≥1 × 106细胞加入最少20µL的培养基，记录加入的培养基体积。为<1 × 106细胞，直接用20µL台盼蓝稀释。将稀释的等分液放在一边直到步骤13。有关执行单元格计数的详细信息血细胞计数器，请参阅以下议定书：如何用血细胞计进行细胞计数.
重要:必须对收集的同质物进行活细胞计数解冻后立即解冻(在洗涤之前)。这将确认所提供的细胞数量，并跟踪洗涤过程中潜在的细胞损失。在清洗过程中，细胞损失可达30%。 - 用移液管将剩余的细胞悬浮液转移到50ml的锥形管中。
- 用1ml培养基冲洗小瓶，并将其滴入细胞中，同时轻轻旋转50ml试管。
- 通过滴入15 - 20毫升培养基洗涤，同时轻轻旋转试管。
- 300倍离心细胞悬液g在室温（15 - 25°C）下放置10分钟。
- 如果使用台盼蓝，对步骤8中稀释的等分液进行细胞计数。
- 用移液管小心地除去上清（从步骤12中），留下少量培养基以确保细胞颗粒不受干扰。轻轻拨动试管，使细胞颗粒重新悬浮。
- 如果细胞开始结块，每mL细胞悬液中加入100µg DNase I溶液，室温孵育15分钟。
注意:如果细胞将用于DNA或RNA提取，则不要添加DNase I溶液。 - 轻轻地向试管中加入15 - 20毫升培养基。
- 300倍离心细胞悬液g在室温下煮10分钟。
- 用移液管小心地除去上清，留下少量培养基，以确保细胞颗粒不受干扰。轻轻拨动试管，使细胞颗粒重新悬浮。
- 细胞现在已经准备好在下游应用中使用，例如细胞培养MethoCult™或ImmunoCult™和细胞分选EasySep™.
第二部分：解冻细胞
注意:建议每次只解冻一个冷冻细胞瓶，以防止在较高温度下长时间暴露于DMSO。
第三部分：细胞清洗和计数
注意:重要的是在以下步骤中快速工作，以确保高细胞活力和恢复。
