用于ES和iPS细胞维护培养的聚合通道
在STEMCELL Technologies，我们的研究科学家经常将人类胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）作为聚集体进行维护培养。这些已建立的方法已被证明允许许多不同细胞系的长期扩增，同时保持供体材料的正常核型。虽然可以将人类胚胎干细胞和iPS细胞作为单个细胞进行传代，但已经证明，这种做法可能会对细胞群体施加不必要的选择压力，从而导致培养中的遗传畸变。1,2另一方面，一些研究人员可能更喜欢单细胞传代，以获得更高的培养密度或与单细胞应用的兼容性。对于这些研究者，我们开发了eTeSR™一种新型的hPSC维持培养基，专门用于在传代和维持hPSC作为单个细胞时维持细胞质量
本技术技巧讨论了群集传代的最佳实践，以及何时适合单细胞传代。还包括使用无酶解离试剂将单层培养物转化为聚集培养物的专门技术温和细胞解离试剂(GCDR;目录#100-0485)和ReLeSR™（目录#05872，#100-0484）。
什么时候传代成聚集体还是单细胞？
- 允许人类胚胎干细胞和iPS细胞的长期扩增，同时保持预期的核型。
- 合适大小的聚集体（50 - 200微米）允许很好地附着在基质上。
- 易于使用和简单的系统，避免对培养的意外影响（不需要ROCK抑制剂）3).
- 用于冷冻保存，流式细胞术，克隆细胞系生成，转染或分化单层电镀，或任何其他终点分析。
- 需要较少的技术培训，涉及更简单的工作流程。
- 如果不熟悉群集传代技术，需要额外的培训。
- 不适合设置下游应用，如特定的分化方案或终点分析，如流式细胞术。
- 需要ROCK抑制剂提高细胞存活率(仅在最初24小时，因为较长时间暴露已显示细胞代谢的变化4和形态5).
- 需要更频繁的遗传分析，以确保核型是预期的。
人类胚胎干细胞和iPS细胞维持的团块传代最佳实践
- 不需要岩石抑制剂。
- 无抗生素（无菌技术是最好的，抗生素可能导致细胞系适应生长良好，只有将其添加到培养基中）。
- 骨料尺寸在50至200µm之间（优化GCDR或ReLeSRTM孵育时间，以保持骨料尺寸，并避免在收获细胞时骨料过度营养）。
- 在第一次更换介质之前，让骨料沉淀24小时。
- 优化你的播种密度总计算和/或播种不同的分裂比例，以便在预定的传代日（通常在第7天左右）以50 - 75%的合流传代细胞。
- 检查你的电池的质量定期通过基因分析和功能分析(核型或使用hPSC基因分析试剂盒[目录#07550]或STEMdiff™三细胞分化试剂盒[目录# 05230])。
完整的说明，请参阅技术手册：维护培养人类多能干细胞mTeSR™1文档(# 10000005505),mTeSR™+文档(# 10000007757),TeSR™e8™（文档#10000005516），或者TeSR™-AOF（文件#10000008160），可在www.stemcell.com或联系我们索取一份副本。
如何从单层通道过渡到聚合通道
使用温和细胞解离试剂
下面是使用的过程温和细胞解离试剂(GCDR;目录#100-0485)产生聚集体传代从单细胞单层培养。给出的体积为6孔板；如果使用替代的培养器皿，根据表面积调整体积。
- 等量TeSR™培养基(mTeSR™1，目录#85850；mTeSR™+，目录号0100-0276；TeSR™e8™，目录号05990；或TeSR™-AOF，目录#100-0401)和温暖到室温（15 - 25°C）。不要在水浴中加热培养基。
- 用1ml /孔的D-PBS（不含钙和镁）;目录#37350)和吸气。
- 加入1ml /孔GCDR，在15 - 25°C孵育4 - 8分钟。
注意：孵育时间可能因多种因素而异，包括细胞系和培养密度。培养物应在4分钟后在显微镜下检查，之后每分钟检查一次，直到培养物类似于图1所示的最佳图像。 - 小心吸入GCDR，注意不要晃动/轻拍盘子。
- 加入1ml /孔的TeSR™培养基。
- 将钢板倾斜约45°角。使用1000µL移液管尖端(目录# 38031)，用笔尖在四个方向上轻轻地在单层培养物上划一个交叉纹：垂直、水平和在两个方向上都成45°角（图2）。
注：评分间隔约0.5 cm，从井壁开始延伸到另一侧。你应该观察到细胞聚集体在刻划板时分离。这是正常的，表明细胞与GCDR孵育了适当的时间。 - 保持培养皿倾斜，用细胞刮板轻轻分离剩余菌落(目录# 200 - 0592 / #200-0594 / #200-0598).
注意：注意尽量减少菌落的分裂。> - 将分离的细胞聚集体转移到15ml的锥形管中(目录# 200 - 0521或目录# 38009).
可选：用额外的1ml TeSR™培养基冲洗孔，收集剩余的细胞聚集体。 - 小心地上下移动细胞聚集体混合物，根据需要分解聚集体。
注：关于如何分解不同类型基质上培养的细胞聚集体，请参阅相应的《TeSR™培养基技术手册》。粒径约为50 - 200微米的集料均匀悬浮是最佳的；不要创建单细胞悬液（图3）。 - 请参考相应的TeSR™培养基技术手册进行细胞的电镀和传代。
图1所示。在GCDR中，在15 - 25°C下，6分钟后，放大40倍的H1人胚胎干细胞细胞系的图像(a)为单层，(B)为6分钟后的图像。
图2。使用移液管，在单层培养物中画出交叉线。
图3。最佳骨料粒径为50 - 200µm，放大倍数为20倍(a)和40倍(B)。
使用ReLeSR™
下面是使用的过程ReLeSR™（目录#05872，#100-0484）从单细胞单层培养产生传代聚集体。给出的体积为6孔板；如果使用替代的培养器皿，根据表面积调整体积。
- 等量TeSR™培养基(mTeSR™1，目录#85850；mTeSR™+，目录号0100-0276；TeSR™e8™，目录号05990；或TeSR™-AOF，目录#100-0401)和温暖到室温（15 - 25°C）。
注意：不要在37°C水浴中加热TeSR™培养基。 - 用1ml /孔的D-PBS（不含钙和镁）;目录#37350)和吸气。
- 每孔加入1ml ReLeSR™，1分钟内抽吸ReLeSR™，使菌落暴露在液体薄膜上。
- 37℃孵育4 - 8分钟。
注意：最佳解离时间可能因所用细胞系而异。第一次用ReLeSR™传代细胞系时，应在4分钟后在显微镜下检查最佳解离时间，之后每隔一分钟检查一次，直到培养物类似于图4所示的最佳图像。 - 加入1ml /孔的TeSR™培养基。
- 用细胞刮刀轻轻刮开菌落(目录# 200 - 0592 / #200-0594 / #200-0598).
- 将分离的细胞聚集体转移到15ml的锥形管中(目录# 200 - 0521或目录# 38009)使用5ml血清学移液管(例如：目录# 38003).
注：粒径约为50 - 200微米的集料均匀悬浮是最佳的；不要创建单细胞悬液（图3）。 - 请参考相应的TeSR™培养基技术手册进行细胞的电镀和传代。
图4。人ES （H1）细胞在40X的放大倍数下(a)作为单层细胞，(B)在37°C的ReLeSR™中4分钟后。
干细胞产品
该程序已经过优化，适用于人类多能干细胞（hPSC）维持试剂和多胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）细胞系。有关上游协议和源材料，请参阅mTeSR™Plus技术手册和产品信息表STEMCELL的高质量控制的健康控制人类iPSC系，女性，SCTi003-A。
| 产品 | 目录# |
|---|---|
| hPSC基因分析试剂盒 | 07550 |
| 基因组DNA纯化试剂盒 | 79020 |
| STEMdiff™三细胞分化试剂盒 | 05230 |
| mTeSR™1 | 85850 |
| mTeSR™+ | 100-0276 |
| TeSR™e8™ | 05990 |
| TeSR™-AOF | 100-0401 |
| 温和细胞解离试剂（GCDR） | 100-0485 |
| ReLeSR™ | 05872, 100-0484 |
| D-PBS（不含ca++和mg++） | 37350 |
| Falcon®血清学移液器，5ml | 38003 |
| 康宁®过滤吸管头，1000µL | 38031 |
| 细胞刮板 | 200-0592, 200-0594, 200-0598 |
| 锥形管，15mL | 200-0521, 38009 |
- Draper等人（2004）在培养的人类胚胎干细胞中染色体17q和12的反复增益。生物工程学报，22(1):53 - 54。
- Buzzard et al.（2004）人类胚胎干细胞在扩展培养过程中的核型。生物工程学报，22(4):382 - 382。
- Beers等人（2012）在化学定义的培养条件下，通过无酶解离对人类多能干细胞进行传代和菌落扩增。Nat协议7(11):2029-40。
- Vernardis等人（2017）暴露于ROCK抑制剂后，人类胚胎和诱导多能干细胞维持表型，但改变其代谢。科学通报7:42 - 38。
- Närvä等人（2017）强收缩肌动蛋白栅栏和大粘连直接人类多能集落形态和粘连。干细胞报告9(1):67-76。
