使用 EasySep™ Release 小鼠阳性分选试剂盒分离 CD45.1 或 CD45.2 阳性细胞
- 文档编号 #27226
- 版本 1.0.0
- 2025年1月
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简介
CD45 是一种存在于所有有核造血细胞表面的 I 型跨膜分子，因其在不同小鼠品系的免疫细胞（如白细胞）中的高表达性，是分离小鼠免疫细胞的理想靶点。1,2 CD45 因其 mRNA 的差异剪接而存在多种异构体。3 在小鼠中，CD45.1 和 CD45.2 是同一功能蛋白的常见异构体，通常用于区分不同遗传背景、品系和细胞群。4 CD45.1 和 CD45.2 的等位基因仅在其胞外域有 5 个氨基酸差异，但胞质域完全相同。4 这种胞外段的细微变化改变了表面表位，使得单克隆抗体能够特异性识别各自的异构体。4 CD45 表达量高，其修饰通常不会影响其他细胞功能。
研究小鼠 CD45.1 和 CD45.2 细胞群是干细胞和免疫学研究的重要工具，具有广泛的应用。例如，通过分析 CD45.1 和 CD45.2 阳性细胞，科学家可以：（1）检测受体小鼠模型的嵌合现象；（2）设计过继转移实验以测试疗法或模拟疾病，分析免疫功能和行为；（3）开展竞争性研究（健康细胞与突变细胞竞争），评估细胞相互作用及其对免疫和非免疫细胞的影响等。1
本技术公告首次推出两种实验方案，相比现有方法具有显著优势——可在细胞分离后释放结合的磁性颗粒。EasySep™ Release 技术能够高效分离高纯度、无颗粒的细胞，支持更流畅的下游分析（如单细胞测序、DNA/RNA 分析等）。
为何选择 EasySep™ Release 技术分离 CD45.1 和 CD45.2 阳性细胞？
- 从目标细胞表面去除磁性颗粒*
- 44-60 分钟内纯度高达 95%
- 单次倾倒即可轻松分离细胞
- 通过温和的 EasySep™ 技术获取功能性细胞
- 适用于起始频率不同的样本
*重要提示：使用 EasySep™ Release 试剂盒分离细胞后，抗体复合物仍结合于细胞表面，可能与 Brilliant Violet™ 抗体偶联物、聚乙二醇修饰蛋白或其他化学相关配体发生相互作用。
EasySep™ Release 技术原理
磁珠分选（免疫磁珠分选或磁珠分选）通过靶向细胞表面抗原的抗体或配体对细胞进行选择或去除。标记的细胞与磁性颗粒（磁珠）交联，施加电磁场后磁珠被固定。小鼠 CD45.1 和 CD45.2 阳性细胞的分离通常采用免疫磁珠阳性分选。分选完成后，磁珠通常仍结合于目标细胞表面。但本技术公告中的方案允许您通过EasySep™ Release 技术在阳性分选后释放结合的磁珠。了解如何分别使用 EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒（货号 17655）和 EasySep™ Release 小鼠 PE 阳性分选试剂盒（货号 17656）分离 CD45.1 和 CD45.2 阳性细胞，并获得无颗粒的高纯度细胞（图 1 和 2）。此外，还可了解如何从起始频率不同的小鼠样本中分离细胞而不影响纯度（图 1B 和 2B）。
样本制备
小鼠脾脏样本处理
制备小鼠脾脏单细胞悬液步骤如下（完整步骤可参考 EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒的产品说明书）：
- 用 EasySep™ 缓冲液（货号 20144）解离脾脏
- 使用 70 μm 尼龙滤网（如货号 27216）去除聚集体和碎片
- 300 x g 离心 10 分钟
- 按表 1（步骤 1）重悬样本，冰上保存备用
注意：分离细胞时不建议使用氯化铵裂解法。
也可参考小鼠脾脏单细胞悬液制备方案及视频。
小鼠骨髓样本处理
制备小鼠骨髓单细胞悬液步骤如下（替代方案可参考 EasySep™ Release 小鼠 CD138 阳性分选试剂盒的产品说明书）：
- 取骨并剪开一端以暴露骨髓
- 将骨骼（每管最多 4 根：2 股骨 + 2 胫骨）放入 0.5 mL 离心管（剪开端朝下）
- 按 Heib 等 2021 方法通过离心收集骨髓细胞：
- 在 0.5 mL 离心管底部扎孔
- 将 0.5 mL 管嵌套于含 100 µL EasySep™ 缓冲液（货号 20144）的 1.5 mL 管中
- 依次加入股骨和胫骨（防止堵塞底部小孔）
- 2500 x g 室温离心 1 分钟
- 合并细胞并用微量移液器混匀
- 用预湿的 70 µm 尼龙滤网（如货号 27216）过滤细胞
- 300 x g 室温离心 10 分钟
- 按表 1（步骤 1）重悬细胞
从其他组织分离小鼠 CD45.1 或 CD45.2 阳性细胞？
可能需要优化条件，请联系 techsupport@stemcell.com 获取支持。
实验步骤
表 1 详细说明了使用 EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒（货号 17655）和 EasySep™ Release 小鼠 PE 阳性分选试剂盒（货号 17656）分别分离 CD45.1（中间列）和 CD45.2（右侧列）阳性细胞的步骤。
重要提示：两种方案均需使用紫色 EasySep™ 磁架（货号 18000），并针对小鼠脾细胞（CD45.1）和小鼠骨髓细胞（CD45.2）优化。
| 操作步骤 | 使用 EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒（货号 17655）分离 CD45.1 阳性细胞 | 使用 EasySep™ Release 小鼠 PE 阳性分选试剂盒（货号 17656）分离 CD45.2 阳性细胞 |
|---|---|---|
1. 按推荐体积调整细胞浓度，用 EasySep™ 缓冲液（货号 20144）重悬细胞。 |
1 x 108 细胞/mL 推荐体积：0.25 - 0.5 mL |
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将样本加入指定规格的管中。 |
5 mL 聚苯乙烯圆底管（如货号 38007） |
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2. 添加 EasySep™ 小鼠 FcR 阻断剂（先于分选抗体加入）。 |
每 mL 样本加 40 μL* |
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3. 加入对应偶联抗体。 注意：可能需要滴定抗体以获得最佳纯度和回收率。请联系 techsupport@stemcell.com 获取建议。 |
每 mL 样本加 0.25 µg 生物素偶联抗小鼠 CD45.1 抗体（克隆 A20，货号 60117BT） |
每 mL 样本加 1.0 µg PE 偶联抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆 104，货号 100-1596） |
混匀并孵育。 |
室温 5 分钟 |
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4. 加入推荐培养基**至指定体积。 |
补至 2.5 mL |
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离心样本。 |
300 x g 离心 10 分钟 |
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5. 加入对应的 EasySep™ Release 阳性分选试剂。 注意：（1）请勿涡旋试剂；（2）可能需要滴定试剂以获得最佳效果，请联系技术支持。 |
每 mL 样本加 50 µL EasySep™ Release 生物素阳性分选试剂 |
每 mL 样本加 50 µL EasySep™ Release PE 阳性分选试剂 |
混匀并孵育。 |
室温 3 分钟 |
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6. 加入 EasySep™ 可释放 RapidSpheres™。 注意：使用前涡旋 RapidSpheres™ 30 秒以确保颗粒均匀分散。 |
每 mL 样本加 100 µL |
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混匀并孵育。 |
室温 3 分钟 |
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7. 进行免疫磁珠分选： |
补至 2.5 mL |
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将无盖管放入紫色 EasySep™ 磁架（货号 18000）。 |
室温静置 5 分钟  |
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拿起磁架，快速倒置并倾倒上清液。取出含目标细胞的离心管。 |
弃去上清液 |
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8. 按指示重复步骤。 |
重复步骤 7： |
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9. 加入 1X EasySep™ Release 缓冲液至指定体积，轻柔吹打混匀 2-3 次。 注意：1X EasySep™ Release 缓冲液需现用现配（用推荐培养基**按 1:40 稀释浓缩液）。 |
补至 2.5 mL |
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孵育。 |
室温 3 分钟 |
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10. 将无盖管放入磁架并孵育。 |
室温静置 5 分钟 |
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11. 拿起磁架，快速倒置并将富集的细胞悬液倒入新管。 |
保留上清液（新管中）：  |
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支持数据：获取无颗粒的高纯度细胞
图 1. 使用 EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒分离 CD45.1 阳性细胞纯度高
实验步骤参考本技术公告“实验步骤”部分（表 1），使用紫色 EasySep™ 磁架（货号 18000）、EasySep™ Release 小鼠生物素阳性分选试剂盒（货号 17655）和生物素偶联抗小鼠 CD45.1 抗体（克隆 A20，货号 60117BT）。
(A) 典型分离纯度达 94.8% ± 2.3%（起始纯度 33.5%，分离后 95.1%）。
(B) 不同起始频率下纯度保持稳定。
将 CD45.1 阳性脾细胞与 CD45.2 阳性脾细胞按约 10%、30%、50% 混合，分离后纯度分别为 94.8% ± 1.1%、94.8% ± 2.3%、95.3% ± 2.2%。
图 2. 使用 EasySep™ Release 小鼠 PE 阳性分选试剂盒分离 CD45.2 阳性细胞纯度高
实验步骤参考本技术公告“实验步骤”部分（表 1），使用紫色 EasySep™ 磁架（货号 18000）、EasySep™ Release 小鼠 PE 阳性分选试剂盒（货号 17656）和 PE 偶联抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆 104，货号 100-1596）。
(A) 典型分离纯度达 94.8% ± 2.4%（起始纯度 29.6%，分离后 95.2%）。
(B) 不同起始频率下纯度保持稳定。
将 CD45.2 阳性骨髓细胞与 CD45.1 阳性骨髓细胞按约 10%、30%、50% 混合，分离后纯度分别为 90.1% ± 1.9%、94.8% ± 2.4%、96.4% ± 0.5%。
产品信息
参考文献
- Mercier FE 等 (2016) Single targeted exon mutation creates a true congenic mouse for competitive hematopoietic stem cell transplantation: the C57BL/6-CD45.1(STEM) mouse. Stem Cell Rep 6(6): 985–92.
- Hermiston ML 等 (2009) CD45, CD148, and Lyp/Pep: critical phosphatases regulating Src family kinase signaling networks in immune cells. Immunol Rev. 228(1): 288–311.
- Penninger JM 等 (2001) CD45: new jobs for an old acquaintance. Nat Immunol. 2(5): 389–96.
- Jang Y 等 (2018) Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. J Immunol. 200(6):1982–7.
- Heib T 等 (2021) Isolation of murine bone marrow by centrifugation or flushing for the analysis of hematopoietic cells - a comparative study. 32(5): 601–7.
