以下流程使用Genomic DNA Purification Kit(产品号 #79020)从培养的细胞或动物组织中分离基因组DNA。需要了解更详细的信息,请参考技术手册(文件 #10000005432)。
用法说明:
A. 细胞裂解液的制备
准备从小鼠尾巴或其它组织,或培养细胞的细胞裂解液,如下所示。
鼠尾或动物组织裂解液
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按表1所示制备消化液。充分混合,并置于冰上。
表1.消化液的制备
组分体积组分组织裂解液体积200 µL组分EDTA体积50 µL组分Proteinase K Solution体积20 µL组分RNase A 溶液体积5 µL组分总体积体积275 µL - 从尖端剪取0.5 - 1.2 cm长的小鼠尾巴或称量20 mg的组织样品,置于一个干净的且无DNase的1.7 mL微量离心管。
- 每个管中加入275 μL消化液。
- 将样品管在55ºC加热块或水浴中孵育过夜(16 - 18小时)。
- 每个样品加入250 μL裂解缓冲液。涡旋混合。
- 继续进行DNA分离。
细胞悬浮液的组织培养细胞裂解液
- 收集1×104至5×106个细胞。用D-PBS洗涤细胞一次。
- 加入150 μL裂解缓冲液。用移液器上下混合。
- 继续进行DNA分离。
B. DNA分离
- 将迷你柱(minicolumn)置于收集管(Collection Tube)中。
- 将步骤1中的裂解混合液转移至迷你柱中。
- 13,000 x g,离心3分钟。从收集管中取出迷你柱并丢弃液体。将迷你柱置于收集管中。
- 加入650 μL柱洗涤缓冲液(加入乙醇)。13,000 x g,离心1分钟。从收集管中取出迷你柱并丢弃液体。将迷你柱置于收集管中。
- 重复步骤5,共洗4次。
- 清空收集管,将迷你柱放回管中。13,000 xg,离心2分钟,以干燥膜。
- 小心转移迷你柱到一个新的标记的1.7 mL微量离心管。
- 迷你柱中加入250 μL无核酶水。室温中孵育1-2分钟。13,000 x g,离心1分钟。对于小鼠尾巴或动物组织裂解液,继续到步骤9。对于组织培养细胞裂解液,继续进行步骤10。
- 加入一个额外的250 μL无核酸酶水到迷你柱。室温中孵育1-2分钟。13,000 x g,离心1分钟。
- 丢弃迷你柱,并将纯化的DNA保存在-20ºC。
注: 对于小鼠尾巴或动物组织裂解液,洗脱体积将约500 μL。对于组织培养细胞裂解液,洗脱体积将约为250 μL。这是推荐的洗脱体积,以获得最佳的DNA产量。较低的洗脱体积可以浓缩DNA,但可能会降低总产量。